IMPLEMENTIERUNG EINER GRAVIMETRISCHEN FEED-STEUERUNG IN PERFUSIONSBASIERTEN ZELLKULTURPROZESSEN

Einführung

Die Perfusionskultur wird seit langem in der Bioprozessierung von Säugetieren eingesetzt. Seit den 1990er Jahren werden mehrere therapeutische Proteine auf diese Weise hergestellt. Später bevorzugte die Industrie das Fed-Batch-Verfahren wegen seiner Einfachheit und Ausbeute, aber die Fortschritte bei der Zellrückhaltung und -kontrolle in den letzten zehn Jahren haben das Interesse an Perfusion als Weg zu höherer Produktivität und Stabilität bei sehr hohen Zelldichten wieder aufleben lassen. (Referenz: Perfusion mammalian cell culture for recombinant protein manufacturing - A critical review, 2018).

Die Perfusion hat eine doppelte Aufgabe: die Beseitigung von Stoffwechselabfällen und die gleichzeitige Bereitstellung frischer Nährstoffe. Die Nährstoffe müssen in einer vorher festgelegten Menge und Geschwindigkeit zugeführt werden, was eine hohe Genauigkeit erfordert (stöchiometrische Fütterung). Dies führt zu einem Widerspruch zwischen der Notwendigkeit einer präzisen Zufuhr und der begrenzten Messauflösung von Hochleistungswaagen, d.h. es muss eine genaue Nährstoffmenge in grossen Volumina des Mediums zugeführt werden, das für die Beseitigung von Stoffwechselnebenprodukten erforderlich ist - eine grundlegende Herausforderung der Perfusionssteuerung.

Um dieses Problem zu lösen und die gewünschte Regelungsleistung zu erzielen, muss die Prozesslogik einen integrierten Ausgleich für inhärente Ungenauigkeiten enthalten. Die Anwendung gravimetrischer Zufuhrkorrekturen ist ein effektiver Weg, um eine solche Kompensation zu ermöglichen. In der Application Note "Präzision in jedem Tropfen - perfekte gravimetrische Dosierung mit der Lucullus®-Software", die Securecell im September 2025 veröffentlicht hat, wird das Prinzip der gravimetrischen Dosierung im Detail erläutert. Eine kurze Zusammenfassung dieser Erläuterung folgt hier unten.

Gravimetrisches Fütterungsprinzip

Dieser Ansatz stützt sich auf Massenmessungen in Echtzeit, um die geförderte Flüssigkeitsmenge direkt zu quantifizieren, und hilft, die inhärenten Schwankungen zu überwinden, die durch die Verformung der Schläuche und zeitabhängige Änderungen der Pumpenleistung entstehen. Der gravimetrische Feed wird in den Fällen eingesetzt, in denen ein hohes Mass an Genauigkeit für die Fütterung des Bioreaktors erforderlich ist. Die Genauigkeit und Präzision der Waage sind von entscheidender Bedeutung, da die Messungen des Gewichts der Feedlösung durch die Waage die Grundlage für die Korrektur des Sollwerts der Feedpumpe bilden. Eine solche Einrichtung wird gemeinhin als gravimetrisch korrigierte Beschickung oder kurz als gravimetrische Beschickung bezeichnet. Zum Einrichten eines gravimetrischen Feeds (Abbildung 1) sind folgende Schritte erforderlich:

• Ein Gerät mit einem eingebauten/programmierten Rückkopplungsmechanismus, der in der Lage ist, die notwendigen Berechnungen für die gravimetrische Feedsteuerung mit einer relativ hohen Frequenz durchzuführen. Einige Bioreaktorsteuerungen verfügen über diese Fähigkeit, aber meistens wird zu diesem Zweck ein Computer mit SCADA-Software wie Lucullus® eingesetzt.
  
  
• Eine Pumpe für die Zuführung der Nährlösung zum Bioreaktor. Dabei kann es sich entweder um eine in die Steuerung des Bioreaktors integrierte Pumpe oder um eine unabhängige, eigenständige Pumpe handeln.
  
  
• Eine Waage zur Messung des Feedgewichts, vorzugsweise mit hoher Präzision.
  
  
• Sowohl die Pumpe als auch die Waage müssen physisch mit dem Gerät verbunden sein, das für die gravimetrische Feedkontrolle zuständig ist, um den Datenaustausch zwischen diesen Geräten zu ermöglichen. Damit die gravimetrischen Korrekturen so wirksam wie möglich sind, müssen die Messungen der Waage und die Korrektur des Pumpensollwerts mit einer relativ hohen Frequenz erfolgen.

Safi Perfusion Betrieb

Das Lucullus®-Operations-Team bei Securecell ist auf Prozessautomatisierung spezialisiert und hat in der Vergangenheit erfolgreich gravimetrische Lösungen zur Korrektur der Zufuhr bei verschiedenen Kunden implementiert, wie kürzlich bei Octarine Bio (Referenz: Application Note "Präzision in jedem Tropfen - perfekte gravimetrische Dosierung mit Lucullus®-Software").

In den vergangenen Monaten wurde eine gravimetrische Dosierkorrekturlösung für einen Perfusionsprozess entwickelt, die von Safi Biotherapeutics (Safi), einem Biotech-Unternehmen mit Standorten in den USA und Großbritannien, konzipiert und optimiert wurde.

Safi Biotherapeutics entwickelt allogene, ex-vivo hergestellte Blutzelltherapien - einschließlich roter Blutkörperchen (RBC) für Transfusionen - in grossem Maßstab und mit tragfähiger Wirtschaftlichkeit. Am britischen Standort konzentriert sich die Arbeit auf die Kultivierung menschlicher Erythrozyten aus hämatopoetischen Stammzellen in Suspensions-Bioreaktoren im Labormassstab.

Die Prozessentwicklung von Safi baut auf jahrzehntelanger industrieller Erfahrung in der Herstellung rekombinanter Proteine mit Säugetierwirten auf. Im Gegensatz zu diesen Produktionssystemen, bei denen sekretierte Moleküle das Produkt sind, sind im Fall von Safi die Zellen selbst das Produkt. Diese Unterscheidung stellt besondere Anforderungen an die Prozessgestaltung: außergewöhnlich hohe Zellzahlen, hohe Lebensfähigkeit, physikalische Integrität und der gewünschte Zellphänotyp sind unerlässlich. Aus dieser Perspektive wird deutlich, dass die Hochdurchsatzperfusion nicht optional, sondern grundlegend ist (Abbildung 2).

Da bei einem Perfusionsprozess ein kontinuierlicher Zufluss des Mediums erforderlich ist, könnte man annehmen, dass dies einfach mit einer genau kalibrierten peristaltischen Pumpe erreicht werden kann. Obwohl peristaltische Pumpen eine hohe Genauigkeit erreichen können, wenn sie unter offenen Prüfstandsbedingungen getestet werden - bei Safi betrug die Genauigkeit von Becher zu Becher etwa 99 % - ist ihre Leistung in einer geschlossenen Bioreaktorumgebung deutlich weniger zuverlässig. In Safi wurden bei den tatsächlichen Kultivierungsläufen Fehler von 15-20 % beobachtet, die auf Gegendruckeffekte und langfristige Verformung der Pumpenschläuche im Dauerbetrieb zurückgeführt wurden.

Um Genauigkeit, Wiederholbarkeit und Konsistenz zu gewährleisten, war eine robustere Feedungssteuerung erforderlich. Der gravimetrische Feed bietet diese Stabilität, da sie sich auf direkte Massenmessungen und nicht auf die angenommene Pumpenverschiebung stützt und somit systematische Drifts aufgrund mechanischer oder druckbedingter Veränderungen ausschließt. Praktischerweise war die Lucullus®-Software bei Safi bereits im Einsatz, denn die Komplexität des Bioprozesses bei Safi erforderte eine agnostische SCADA-Plattform zur Koordinierung mehrerer Regelkreise und Datenströme.

In diesem Artikel wird beschrieben, wie die Teams von Securecell und Safi in enger Zusammenarbeit einen gravimetrischen Feedvorgang für Lucullus® entwickelten. Während dieser Arbeit wurde erkannt, dass es effektiver ist, das Integral zu verfolgen, um die korrekte Gesamtmedienzufuhr über einen bestimmten Zeitraum zu gewährleisten, als der Steigung nachzujagen, d.h. die momentane Feedrate ständig zu korrigieren. Dieser Perspektivwechsel veränderte unser Verständnis davon, was genaue Feedkontrolle in einem Perfusionsprozess bedeutet.

Materialien und Methoden

Für die Durchführung der Prozesse mit gravimetrischer Zufuhr bei Safi wurden die folgenden Geräte verwendet (Abbildung 3):

Prozesssteuerungssoftware:
Lucullus® (Version 24.1.1, Basic + Control Lizenz)

Bioreaktor-Prozesssteuerung:
Benchtop-Bioreaktor-Prozesssteuerung zur lokalen Ausführung von Prozesssteuerungsfunktionen

Bioreaktorgefässe:
1-L- und 10-L-Edelstahl- und Glasgefässe sowie kundenspezifische Einweg-Bioreaktorgefäße; Gefäßtyp und Maßstab werden je nach Versuchsplan ausgewählt

Zufuhr- und Abfallpumpen:
Freistehende, Labor-Peristaltikpumpen für die Zugabe von Medium und die Entfernung von verbrauchtem Medium

Messung der Beschickungsmasse:
Integrierte Massenwaage mit Lucullus® zur gravimetrischen Kontrolle der Beschickung

Zellrückhaltesystem:
Alternating Tangential Flow (ATF) oder Tangential Flow Filtration (TFF) basierte Zellrückhaltesysteme, die je nach experimentellen Anforderungen ausgewählt werden

Ergebnisse und Diskussion

Überlegungen zur Prozessautomatisierung

Die bei Safi angewandte Betriebslogik unterscheidet sich von Securecells Ansatz in früheren Projekten, bei denen die gravimetrische Dosierung hauptsächlich zur genauen Steuerung der Dosierung in Fed-Batch-Prozessen eingesetzt wurde. In diesen Fällen war die Dosierung volumenbegrenzt und folgte einer berechneten Dosierkurve (siehe Application Note "Präzision in jedem Tropfen - perfekte gravimetrische Dosierung mit Lucullus®-Software").

Im Gegensatz dazu muss Safis Prozess einen relativ umfangreichen kontinuierlichen Zu- und Abfluss aufrechterhalten, während die Zellen im Bioreaktor verbleiben. Die Umstellung von der Zufuhrkorrektur auf die Perfusionssteuerung erfordert die Programmierung zusätzlicher Logikelemente, wie z. B. die kontinuierliche Entfernung des Mediums, die durch einen Füllstandssensor ausgelöst wird, wenn ein bestimmter Flüssigkeitsstand im Bioreaktor erreicht ist. Es ist wichtig zu beachten, dass das Vorhandensein der Zellrückhaltevorrichtung, bei der das Permeat durch eine HFF-Patrone (Hohlfaserfiltration) geleitet wird, einen zusätzlichen und variablen hydraulischen Widerstand darstellt.

In Anbetracht der größeren Arbeitsvolumina und der erforderlichen Flexibilität bei den verschiedenen Bioreaktorskalen (950 mL - 30 L) sind Waagen mit hoher Kapazität (bis zu 35 kg) erforderlich, die in der Regel eine geringere Auflösung bieten: 5 g im Fall von Safi. Dies stellt eine Herausforderung für die effektive Anwendung gravimetrischer Korrekturen an der Bioreaktorzufuhr dar, wofür sich Waagen mit einer hohen Auflösung besonders eignen.

Ein weiterer Unterschied zu früheren Arbeiten besteht darin, dass das Safi-System anstelle eines robusten, produktionsorientierten Prozesses, der auf Reproduzierbarkeit und Durchsatz optimiert ist, in der F&E-Phase eines komplexen, variablen und biologisch sensiblen Prozesses verbleibt. Um dies zu unterstützen, muss in die Lucullus-Logik eine größere Flexibilität eingebaut werden, um häufige Prozessänderungen und den täglichen Betrieb des Bioreaktors, wie z.B. häufige Änderungen der Dosierflaschen und der Dosiersollwerte, zu ermöglichen.

Anwendung von gravimetrischen Korrekturen auf einen Perfusionsprozess

Bei den derzeit von Safi durchgeführten Prozessen wird die eingestellte Feedrate über einen längeren Zeitraum hinweg konstant gehalten. Die eingestellte Feedrate kann zu einem bestimmten Zeitpunkt während des Prozesses durch den Bediener geändert werden. Die Vorschubgeschwindigkeiten sind zu Beginn des Prozesses nicht immer vordefiniert, was den explorativen und adaptiven Charakter der F&E-Arbeiten widerspiegelt.

Im Prinzip sollte es recht einfach sein, gravimetrische Korrekturen an der Förderpumpe vorzunehmen, wenn eine feste Rate eingestellt ist; bei einer dynamischen Förderrate (die linear, exponentiell oder nach einem vorgegebenen Profil ansteigt) stellt dies eine größere Herausforderung dar (siehe: Application Note "Präzision in jedem Tropfen - perfekte gravimetrische Fütterung mit der Lucullus®-Software").

Im Fall von Safi war es jedoch aufgrund der verfügbaren Ausrüstung (Waagen mit einer relativ geringen Genauigkeit von 5 g) nicht möglich, die gleiche Strategie für die Anwendung gravimetrischer Korrekturen wie in früheren Fällen effektiv umzusetzen. Das in diesen Fällen angewandte Prinzip bestand darin, die Fördermenge der Förderpumpe direkt mit einer relativ hohen Frequenz zu korrigieren, indem die tatsächliche Fördermenge auf der Grundlage von zwei aufeinanderfolgenden Waagenmessungen berechnet und der Fehler (Differenz zur gewünschten Fördermenge) zur Korrektur des Sollwerts der Förderpumpe verwendet wurde.

Als dieses Prinzip bei Safi eingeführt wurde, führte die Kombination aus relativ niedrigen Fördermengen, sehr ungenauen Waagenmessungen und relativ kurzen Zyklen (in der Größenordnung von einigen Minuten) zu einer sehr schlechten Leistung, wobei die gravimetrischen Korrekturen mehr schadeten als nutzten. Daher wurde beschlossen, für die Prozesse von Safi einen anderen Ansatz zu wählen: Anstatt die Korrekturen auf der Grundlage der aktuellen Feedrate zu berechnen, sollten sie auf der Grundlage der gesamten seit dem Start der Feedpumpe dosierten Menge erfolgen (und auf der gleichen Zielrate gehalten werden).

Zu diesem Zweck wird die Messung des Feedgewichts zum Zeitpunkt des Starts der Feedpumpe erfasst (Parameter weight_start). Nachfolgende Gewichtsmessungen werden dann vom Startgewicht abgezogen, was die Gesamtmenge der zu einem bestimmten Zeitpunkt dosierten Feedlösung ergibt. Diese Menge wird dann durch die Zeit geteilt, die seit dem Start der Feedpumpe vergangen ist, was die tatsächliche Feedmenge während dieser Zeit ergibt (Parameter feed_rate_av). Diese wird von der gewünschten Feedrate (Parameter feed_rate_target) abgezogen; aus der Differenz (Parameter feed_error) wird dann der gravimetrische Korrekturfaktor (Parameter FCF) berechnet, der sich aus einer proportionalen Komponente (Parameter PCF) und einer integralen Komponente (Parameter ICF) zusammensetzt.

Die geringe Genauigkeit der Feedwaage erschwert eine stabile Regelung in mehrfacher Hinsicht:

1. Der erste von der Waage erfasste Zuwachs erwies sich als systematisch unzuverlässig. Obwohl der Waagenwert um einen diskreten Schritt von 5 Gramm sank, konnte die tatsächlich in den Bioreaktor eingebrachte Feedmenge zwischen 0 und 5 Gramm liegen.
   
   

2. Insbesondere bei niedrigen Feedraten neigten die Messungen der Waage zum Wackeln, d.h. trotz der Entnahme von Flüssigkeit aus der Feedflasche konnten die Gewichtsmessungen in Schritten von 5 Gramm nach oben und unten schwanken. Dies machte die Erfassung eines bestimmten Waagenwerts, der für weitere Berechnungen verwendet werden sollte, zu einem unsicheren Faktor.
   
   

3. Die Erfassung von Waagenmessungen in einem festen Zeitraum (Fütterungszyklus), wie in früheren, vergleichbaren Arbeiten, hat ebenfalls nicht gut funktioniert. Die Erhöhung des Waagenmesswerts um 5 Gramm unmittelbar nach der Erfassung der Messung für die nachfolgenden Berechnungen würde zu einer zusätzlichen Ungenauigkeit des gravimetrischen Korrekturfaktors FCF führen.

Diese drei Phänomene waren besonders in der Anfangsphase der Fütterung nachteilig. Mit fortschreitender Zeit würden ihre Auswirkungen auf die gravimetrischen Korrekturen immer weniger ins Gewicht fallen. Das Hauptziel von Safi bestand darin, am Ende der Fütterungsperiode eine sehr genaue Dosierung zu haben, die Perioden der Über- und Unterfütterung zulässt, solange sich diese am Ende ausgleichen. Dennoch wurden Schritte unternommen, um (vorübergehende) Über- und Unterfütterungen so weit wie möglich zu minimieren.

1. Um das Problem mit dem ersten Schritt der Waagenablesung zu vermeiden, wurde Lucullus® so programmiert, dass das Startgewicht (Parameter weight_start) erst nach der Erfassung des zweiten Schrittes erfasst wird.
   
   

2. Um das Wackeln der Waage auszugleichen, wurde das Lucullus® Logical Device NSA verwendet, um das durchschnittliche Feedgewicht (Parameter weight_av) zu berechnen, das auf den letzten 10 aufgezeichneten Waagenmessungen basiert. Nachfolgende Berechnungen wurden dann ausschließlich mit diesem gemittelten Gewicht durchgeführt, anstatt mit der letzten aufgezeichneten Gewichtsmessung. Dies trug nicht nur dazu bei, das Taumeln zu glätten, sondern sorgte auch für eine zusätzliche Auflösung der Gewichtswerte, d.h., das Durchschnittsgewicht änderte sich in Schritten von weniger als 5 Gramm.
   
   

3. Anstatt eine feste Frequenz für den Fütterungszyklus vorzuschreiben, wurde Lucullus® so programmiert, dass eine signifikante Änderung des Feedgewichts (Parameter DBSI) mit einem Standardwert von 5 Gramm oder mehr abgewartet wird, bevor ein neuer gravimetrischer Korrekturfaktor berechnet wird. Zu diesem Zweck wurde das (gemittelte) Feedgewicht zu Beginn eines jeden neuen Fütterungszyklus erfasst (Parameter weight_cyc_init).

Der gesamte Mechanismus zur Anwendung gravimetrischer Korrekturen auf den Sollwert der Feedpumpe wird weiter unten in Abbildung 4, Abbildung 5, Abbildung 6 und Abbildung 7 dargestellt.

Robustheit in den Betrieb implementieren

Eine der ersten Funktionen, die eingeführt wurde, um die Operation robuster zu machen, war ein Parameter namens abort_flag. Der Hauptzweck dieses Parameters besteht darin, die automatische Steuerung der Förderpumpe durch Lucullus® außer Kraft zu setzen, falls ein manueller Eingriff erforderlich ist. Wird diesem Parameter vom Bediener der Wert 1 zugewiesen, wird die gravimetrisch korrigierte Feedrate (Parameter feed_rate_corr) ignoriert und stattdessen eine benutzerdefinierte, feste Feedrate dem Sollwert der Förderpumpe zugewiesen (Parameter feed_rate_target). In Abbildung 7 ist die Steuerlogik für die Regelung der Förderpumpe im Detail dargestellt.

Eine der Besonderheiten der für Safi programmierten Lösung im Vergleich zu früheren Lösungen ist die Anwendung von Korrekturen auf die Förderpumpe auf der Grundlage der gemessenen Gesamtmenge der von dieser Pumpe über einen längeren Zeitraum dosierten Förderlösung anstelle der berechneten Förderrate über einen relativ kurzen Zeitraum. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass zwei Anforderungen, die in der Einleitung dieses Artikels genannt wurden, nicht mehr erfüllt werden müssen:

• Die Waage zur Messung des Vorschubgewichts muss nicht sehr genau sein, und es können auch bei einer Waage mit geringer Genauigkeit gute Ergebnisse erzielt werden.
  
  

• Es ist nicht notwendig, die Messungen der Waage zu sammeln und den Sollwert der Pumpe mit einer relativ hohen Frequenz zu korrigieren. Die Korrektur mit einer niedrigen Frequenz trägt sogar dazu bei, die Auswirkungen einer schlechten Waagengenauigkeit zu Beginn des Vorschubs zu dämpfen, wenn diese am schädlichsten ist.

Wie bereits erwähnt, besteht eine inhärente Schwäche dieser Methode darin, dass bei Verwendung einer Waage mit geringer Genauigkeit die berechnete Menge des dosierten Feeds in den frühen Phasen der Fütterung stark von der tatsächlich dosierten Menge abweicht. Eine Korrektur der Feedpumpe auf der Grundlage der berechneten Menge des dosierten Feeds schadet in dieser Phase mehr, als sie nützt. Deshalb ist es am besten, die Feedpumpe eine Zeit lang laufen zu lassen, ohne gravimetrische Korrekturen vorzunehmen. Mit der Zeit wird die Differenz zwischen dem Startgewicht und dem aktuellen Gewicht auf der Feedwaage immer größer, bis der Punkt erreicht ist, an dem die Ungenauigkeit der Waage im Vergleich zur Gewichtsdifferenz unbedeutend ist. An diesem Punkt wäre es sicher, gravimetrische Korrekturen für die Förderpumpe zu ermöglichen.

Es kann daher einige Zeit dauern, bis der Feed korrigiert wird. Glücklicherweise ist der Algorithmus dann in der Lage, den Feed zu korrigieren, um eine Unter- oder Überfütterung in dem Zeitraum vor der Aktivierung der gravimetrischen Korrekturen auszugleichen. Wie viel Zeit für das Abwarten der gravimetrischen Korrekturen reserviert werden muss, hängt von den verwendeten Geräten (Waagengenauigkeit) und den jeweiligen Prozessbedingungen (Vorschubgeschwindigkeit) ab und sollte daher für jede einzelne Situation individuell bestimmt werden.

Ein weiterer Nachteil dieser Methode ist die Störanfälligkeit, insbesondere die Störung des von der Feedwaage angezeigten Gewichts. Man denke an die folgenden Szenarien:

1. Die Waage wird nur kurz gestört, und das Gewicht verschiebt sich vorübergehend, kehrt dann aber wieder auf mehr oder weniger denselben Wert wie vor der Störung zurück. In einigen Fällen kann die Waage aufgrund einer Kommunikationsstörung oder der Auslösung einer eingebauten Funktion, wie z. B. "Autotara", vorübergehend 0 anzeigen.
   
   

2. Die Waage wird kurzzeitig gestört, das Gewicht verschiebt sich und kehrt nicht auf den (mehr oder weniger) gleichen Wert wie zuvor zurück, sondern auf einen deutlich höheren oder niedrigeren Wert.
   
   

3. Die Waage wird über einen längeren Zeitraum gestört, z.B. weil der Feedbehälter ausgetauscht wird.
   
   

4. Die Zielvorgabe für die Vorschubgeschwindigkeit wird zu irgendeinem Zeitpunkt während des Prozesses geändert.

Bei all diesen Szenarien wurde ein Schutzmechanismus eingeführt, der den Einfluss relativ großer Störungen auf die Berechnung des gravimetrischen Korrekturfaktors FCF abmildert. Dies wird dadurch erreicht, dass die Grenzwerte für die Regelleistung (Parameter co_lim_p und co_lim_i) in den Gleichungen als harter Cut-Off für die Berechnung der Parameter PCF bzw. ICF verwendet werden (Schritt "Korrekturen berechnen").

In Szenario 1 sind die Auswirkungen auf die Vorschubgenauigkeit begrenzt. In den meisten Fällen wird die Störung erst in der Mitte des Einspeisezyklus auftreten und dann wieder verschwinden, bevor der Korrekturfaktor für den Sollwert der Einspeisepumpe FCF berechnet wird. Wenn dies geschieht, hat die Störung keinen Einfluss mehr auf die Berechnung. Tritt die Störung kurz vor der Berechnung der Korrektur des Förderpumpensollwerts auf, wirkt sie sich unerwünscht auf diese Berechnung aus, und der Förderpumpensollwert wird zu stark oder zu wenig angepasst.

Dies wird jedoch in den nachfolgenden Fütterungszyklen korrigiert, sofern keine weiteren Störungen die Berechnung der gravimetrischen Korrektur während dieser Zeit direkt beeinflussen. Bei dem für Safi programmierten gravimetrischen Vorschubbetrieb wird dies gänzlich vermieden. Dies wird erreicht, indem die Standardabweichung des gemittelten Feedgewichts (Parameter weight_dev) verfolgt und mit einem benutzerdefinierten Grenzwert (Parameter DBDW) verglichen wird. Wird dieser Grenzwert überschritten, pausiert Lucullus® die gravimetrischen Korrekturen, bis die Abweichung unter den Grenzwert fällt. An diesem Punkt setzt Lucullus® das Startgewicht zurück (Parameter weight_start) und die gravimetrischen Korrekturen werden von vorne begonnen (Abbildung 8 und Abbildung 9).

In den Szenarien 2 und 3 sind die Auswirkungen auf die Feedgenauigkeit gravierender, wobei der Schweregrad davon abhängt, wie stark die Feedgewichtsmessung durch die Störung verschoben wurde. Obwohl der gravimetrische Korrekturfaktor FCF bei jeder Berechnungsrunde durch die Ausgangsgrenzwerte co_lim_p und co_lim_i der Steuerung begrenzt wird, schafft es Lucullus® schließlich, die Verschiebung des Feedgewichts auf der Waage vollständig zu korrigieren. Werden keine Maßnahmen ergriffen, führt dies zu einem Fehler in der tatsächlich dosierten Feedmenge, d.h. die insgesamt zu dosierende Feedmenge wird entweder unter- oder überdosiert. Um dies zu vermeiden, wäre Folgendes erforderlich:

• Im Falle von Szenario 2 müsste Lucullus® so programmiert werden, dass es die Verschiebung des Feedgewichts erkennt und entsprechend reagiert, um die Verschiebung zu korrigieren. Der für Szenario 1 beschriebene Mechanismus, der auf der Standardabweichung des gemittelten Feedgewichts basiert, ist auch in der Lage, die in Szenario 2 beschriebene Verschiebung des Feedgewichts effektiv zu bewältigen.
  
  

• Im Falle von Szenario 3 wird die Verschiebung des Feedgewichts vorweggenommen, und Lucullus® wurde so programmiert, dass es damit zurechtkommt (Abbildung 10). Ein spezieller Zweig im Parallelblock, der aus 4 Schritten besteht, ermöglicht es dem Bediener, anzuzeigen, dass ein Flaschenwechsel bevorsteht, und zu melden, wenn der Austausch abgeschlossen ist. Während des Flaschenwechsels werden die gravimetrischen Korrekturen unterbrochen. Sobald der Austausch abgeschlossen ist, wird das für die Berechnung der Dosierkorrekturen verwendete Startgewicht zurückgesetzt. Die gravimetrischen Korrekturen beginnen dann von Neuem.
  
  

• Im Falle von Szenario 4 ist keine Verschiebung des Feedgewichts zu erwarten, aber das für die Feedkorrekturberechnung verwendete Startgewicht muss zurückgesetzt werden. Geschieht dies nicht, korrigiert Lucullus® den Sollwert der Feedpumpe auf der Grundlage der Historie des mit dem vorherigen, abweichenden Sollwert dosierten Feeds. Dies führt zu ungerechtfertigten und überflüssigen Korrekturen. Um dies zu vermeiden, wurde ein weiterer spezieller Zweig im Parallelblock, bestehend aus 4 Schritten, in die Operation für Safi eingeführt (Abbildung 11). Er ist dem für den Flaschentausch programmierten Zweig sehr ähnlich, mit dem Hauptunterschied, dass die Förderpumpe in diesem Szenario nicht vorübergehend angehalten wird. Beachten Sie, dass im Fall von Safi die Zufuhrrate über einen längeren Zeitraum konstant gehalten wird, sowohl vor als auch nach der Änderung der Zielzufuhrrate, was die Anwendung der hier beschriebenen besonderen Strategie ermöglicht.

Abbildung 9: Im Schritt "Gravimetrische Fütterung" wird der Parameter feed_count bei jedem Fütterungszyklus erhöht (feed_count = feed_count +1), es sei denn, der Parameter corr_flag ist 0. Ist dies der Fall, wird feed_count auf 0 zurückgesetzt (feed_count - @if(corr_flag = 0; 0; feed_count)). Dies geschieht typischerweise als Folge einer ungeplanten Störung des Feedgewichts, eines geplanten Flaschentauschs oder einer geplanten Änderung des Vorschubziels. Sobald corr_flag von 0 zurück auf den Wert 1 wechselt, beginnt feed_count wieder mit der Inkrementierung. Wenn er den Wert 2 erreicht hat, erhält das Startgewicht einen neuen Wert, der auf dem aktuell berechneten gemittelten Feedgewicht basiert (weight_start = @if(feed_count = 2 AND corr_flag = 1; weight_av; weight_start)). Im nächsten Vorschubzyklus werden dann die gravimetrischen Korrekturen wieder aufgenommen.

Abbildung 10: Die Verzweigung im Parallelblock der Operation, die für einen Flaschentausch zuständig ist. Die blauen Schritte bezeichnen sogenannte manuelle Schritte, d.h. Schritte, die der Interaktion mit dem Bediener dienen. Bei der Ausführung des ersten Schrittes bittet Lucullus® den Bediener um Bestätigung, dass die Flasche ausgetauscht werden soll. Wenn dies geschehen ist, stoppt Lucullus® die Förderpumpe (pmp_feed_md = 0), setzt die gravimetrischen Korrekturen zurück (feed_count = 0) und friert den Förderzyklus ein, indem es dem Parameter chng_feed_flag den Wert 1 zuweist. Anschließend wird der dritte Schritt ausgeführt und Lucullus® bittet den Bediener um Bestätigung, dass die Flasche ausgetauscht wurde. Wenn dies geschehen ist, startet Lucullus® die Zuführpumpe neu und hebt das Einfrieren des Zuführzyklus auf, indem es dem Parameter chng_feed_flag den Wert 0 zuweist. Nun beginnt Lucullus® erneut mit der Anwendung der gravimetrischen Korrekturen. Gleichzeitig kehrt der letzte Schritt in diesem Zweig zum ersten Schritt zurück und wartet darauf, dass der Bediener Lucullus® zu einem späteren Zeitpunkt einen weiteren Flaschentausch mitteilt.

Abbildung 11: Der Zweig im Parallelblock des Vorgangs, der für eine Änderung des Sollvorschubs zuständig ist. Die blauen Schritte kennzeichnen sogenannte manuelle Schritte, d.h. Schritte, die der Interaktion mit dem Bediener dienen. Bei der Ausführung des ersten Schrittes bittet Lucullus® den Bediener zu bestätigen, dass der Sollvorschub geändert werden soll. Wenn dies geschehen ist, setzt Lucullus® die gravimetrischen Korrekturen zurück (feed_count = 0) und friert den Vorschubzyklus ein, indem es dem Parameter chng_feed_flag den Wert 1 zuweist. Anschließend wird der dritte Schritt ausgeführt, und Lucullus® fordert den Bediener auf, die Änderung der Soll-Vorschubgeschwindigkeit zu bestätigen. Wenn dies geschehen ist, hebt Lucullus® das Einfrieren des Vorschubzyklus auf, indem es dem Parameter chng_feed_flag den Wert 0 zuweist. An diesem Punkt beginnt Lucullus® erneut mit der Anwendung der gravimetrischen Korrekturen. Gleichzeitig kehrt der letzte Schritt in diesem Zweig zum ersten Schritt zurück und wartet darauf, dass der Bediener Lucullus® zu einem späteren Zeitpunkt eine weitere Änderung der Zielvorschubgeschwindigkeit mitteilt.

Die finale Operation

Die für Safi entwickelte Operation enthält mehr Funktionen, als bisher in diesem Artikel besprochen wurden. Unter anderem enthält sie eine benutzerfreundliche Option zur Auswahl der gewünschten Pumpen für die Beschickung und Entlüftung (in beiden Fällen sind 3 Optionen möglich). Eine weitere, parallel ausgeführte Funktion ist für die Aufrechterhaltung eines stabilen Arbeitsvolumens im Reaktor verantwortlich, indem eine Entlüftungspumpe aktiviert wird, sobald die Flüssigkeit im Reaktor den Füllstandssensor berührt. Die gesamte Operation ist in Abbildung 12 zu sehen.

Abbildung 12: Überblick über die endgültige Version des vollständigen gravimetrischen Vorgangs. Die gelb markierten Schritte werden von Lucullus® automatisch ausgeführt, während die blau markierten Schritte eine Eingabe des Bedieners erfordern, bevor Lucullus® zum nächsten Schritt übergehen kann. Am Anfang der Schrittkette erlauben die blau markierten Schritte "Choose feed pump" und "Choose bleed pump" dem Bediener, sowohl für die Feed- als auch für die Bleed-Pumpe eine bestimmte Pumpe aus einer Auswahl von drei verfügbaren Pumpen auszuwählen, was dem Benutzer zusätzliche Flexibilität bietet (die verschiedenen Pumpen haben unterschiedliche Kapazitäten). Wenn der Bediener die Inokulation bestätigt hat, geht Lucullus zum Parallelblock "Perfusion" über und führt dann die 5 Zweige dieses Parallelblocks gleichzeitig aus. Von links nach rechts haben diese Verzweigungen folgende Funktionen: Ausführen von Feed- und gravimetrischen Korrekturen, Ändern der Soll-Feedrate, Wechseln der Futterflasche, Entfernen überschüssiger Flüssigkeit (Entlüftung) und Verfolgen der Entwicklung des Feedgewichts auf der Waage.

Leistung

Die Leistung der endgültigen Version der Operation wurde während der Live-Kulturen in Safi getestet, und es wurde Folgendes erreicht: stabile und robuste Regelung der kumulativen Menge des dosierten Feeds. Der Algorithmus ist in der Lage, den Austausch der Feedflasche, Änderungen des Feedollwerts und vorübergehende Störungen des Gleichgewichts wirksam zu bewältigen. Nach dem anfänglichen Start der Feeds, einem Feedflaschenwechsel oder einer Änderung des Feedsollwerts dauert es einige Stunden, bis sich die tatsächliche (gemittelte) Feedmenge auf die gewünschte Soll-Feedmenge einpendelt. Bei höheren Feespumpen-Sollwerten ist diese Zeitspanne in der Regel kürzer. Die Schwankungen der tatsächlichen (gemittelten) Feedrate im Vergleich zur Soll-Feedrate sind unmittelbar nach dem ersten Start des Feeds, einem Feedflaschenwechsel oder einer Änderung des Feedsollwerts am größten, wenn sich die Ungenauigkeiten der Waagenablesung relativ stark auf die Berechnungen der tatsächlichen (gemittelten) Feedrate auswirken. Diese Schwankungen nehmen mit der Zeit ab, solange die Bedingungen stabil bleiben (kein Feedflaschenwechsel, keine Änderung des Feedsollwerts oder Waagenstörungen). Durch den Einsatz dieser Lucullus®-Operation konnte Safi während dieser Kulturen mit einer Abweichung von 0,5 % oder sogar weniger füttern. Dies wird in Abbildung 13, Abbildung 14, Abbildung 15 und Abbildung 16 weiter verdeutlicht.

Abbildung 13: Leistung des gravimetrischen Feedkorrekturalgorithmus für den Anbau "Lauf A". Bei der Durchführung dieses Laufs wurden relativ niedrige Zielvorschubraten verwendet, die zwischen 0,46 und 1,40 g/min lagen. Die horizontale Achse zeigt die Zeit [h] seit dem Start des Prozesses in Lucullus®, die vertikale Achse zeigt die Vorschubgeschwindigkeit [g/min]. In dieser Grafik sind drei Parameter aufgetragen: die Soll-Förderrate (schwarze Kurve), die tatsächliche (gemittelte) Förderrate (rote Kurve) und der Sollwert für die Förderpumpe (blaue Kurve). Während des Anbaus wurde der Feedsollwert zunächst zweimal erhöht und später viermal gesenkt. Außerdem wurden während des Zeitraums, in dem die Kultivierung mit der höchsten Feedsrate erfolgte, mehrere Feedflaschen ausgetauscht. Die rote und die blaue Kurve zeigen die Schwankungen nach jedem Feedrflaschenwechsel bzw. nach jeder Änderung des Sollwerts, die sich im Laufe der Zeit abschwächen, wobei die rote Kurve schließlich die schwarze Kurve vollständig überlappt. Man beachte die sich ständig ändernde Abweichung zwischen der angestrebten Feedrate und dem Sollwert der Feedpumpe, was deutlich zeigt, dass gravimetrische Korrekturen erforderlich sind, um eine ausreichend genaue Fütterung zu gewährleisten.

Abbildung 14: Detaillierte Darstellung der Feedregelung für den Anbau "Run A" in der Endphase des Prozesses. Die horizontale Achse zeigt die Zeit [h] seit Beginn des Prozesses in Lucullus®, die vertikale Achse zeigt die Feedrate [g/min]. In dieser Grafik sind drei Parameter aufgetragen: die Soll-Förderrate (schwarze Kurve), die tatsächliche (gemittelte) Förderrate (rote Kurve) und der Sollwert für die Förderpumpe (blaue Kurve). Deutlicher als in Abbildung 13 sind die Schwankungen der roten und blauen Kurve nach jeder Änderung des Feedsollwerts und die Überlappung der roten Kurve mit der schwarzen Kurve zu erkennen. Ebenfalls deutlicher zu erkennen sind in diesem Diagramm die Anpassungen, die Lucullus® am Sollwert der Förderpumpe vornimmt, um die tatsächliche (gemittelte) Förderrate in Richtung der Zielförderrate zu drücken, was durch die nach oben oder unten geneigte blaue Kurve angezeigt wird.

Abbildung 15: Leistung des Algorithmus zur Korrektur der gravimetrischen Fütterung für den Anbau "Lauf B". Während der Durchführung dieses Laufs wurden relativ hohe Zielvorschubraten verwendet, die zwischen 4,6 und 6,9 g/min lagen. Die horizontale Achse zeigt die Zeit [h] seit dem Start des Prozesses in Lucullus®, die vertikale Achse zeigt die Vorschubgeschwindigkeit [g/min]. In dieser Grafik sind drei Parameter aufgetragen: die Soll-Förderrate (schwarze Kurve), die tatsächliche (gemittelte) Förderrate (rote Kurve) und der Sollwert für die Förderpumpe (blaue Kurve). Während dieses Anbaus wurde der Feedsollwert zweimal erhöht. Außerdem wurden während des Zeitraums, in dem die Kultivierung mit der höchsten Feedrate erfolgte, mehrere Feedflaschen ausgetauscht. Die rote und die blaue Kurve zeigen Schwankungen nach jedem Feedflaschenwechsel bzw. nach jeder Änderung des Sollwerts, die sich im Laufe der Zeit abschwächen, wobei sich die rote Kurve schließlich vollständig mit der schwarzen Kurve überlappt. Man beachte die nach oben driftende Abweichung zwischen der angestrebten Feedrate und dem Sollwert der Feedpumpe, die in drei verschiedenen Teilen der Grafik zu sehen ist (8 - 19 h, 32 - 42 h, 52 - 69 h), was eindeutig auf die Notwendigkeit gravimetrischer Korrekturen hinweist, um eine ausreichend genaue Fütterung zu gewährleisten.

Abbildung 16: Detaillierte Darstellung der Feedregelung für den Anbau "Run B" während der Anfangsphase des Prozesses. Die horizontale Achse zeigt die Zeit [h] seit Beginn des Prozesses in Lucullus®, die vertikale Achse zeigt die Feedrate [g/min]. In dieser Grafik sind drei Parameter aufgetragen: die Soll-Förderrate (schwarze Kurve), die tatsächliche (gemittelte) Förderrate (rote Kurve) und der Sollwert für die Förderpumpe (blaue Kurve). Deutlicher als in Abbildung 15 sind die Schwankungen der roten und blauen Kurve nach den Feedflaschenwechseln und der einmaligen Sollwertänderung zu erkennen, wobei sich die rote Kurve ab 30 h über der schwarzen Kurve stabilisiert. Ebenfalls deutlicher zu erkennen sind in dieser Grafik die Anpassungen, die Lucullus® am Sollwert der Feedpumpe vornimmt, um die tatsächliche (gemittelte) Feedrate in Richtung der Soll-Feedrate  zu drücken, was durch die aufwärts geneigte blaue Kurve im Zeitraum von 25 bis 40 Stunden angezeigt wird.

Künftige Verbesserungen

Während der Vorbereitung dieser Arbeit nahmen mehrere neue Ideen Gestalt an. Eine vielversprechende Richtung ist die Entkopplung von Perfusion und Nährstoffzufuhr. Bei diesem Konzept würde der Austausch des reinen Mediums separat gesteuert werden, um die Stabilität der Umgebung zu erhalten und metabolische Nebenprodukte zu entfernen, während die Nährstoffzufuhr einem unabhängigen gravimetrischen Kontrollprofil folgen würde, das sich am metabolischen Bedarf orientiert. Diese Trennung könnte die Steuerungslogik erheblich vereinfachen und gleichzeitig die Genauigkeit und Robustheit verbessern. Zukünftige Arbeiten werden untersuchen, wie eine solche Entkopplung in die Lucullus®-Logik implementiert und experimentell in verschiedenen Größenordnungen von Bioreaktoren getestet werden kann.

Eine weitere Verbesserung wäre die Einbeziehung anderer Fütterungsstrategien als einer konstanten Fütterung, z.B. eine linear oder exponentiell ansteigende Fütterung. Dies würde auch einen anderen Ansatz für die Berechnung der gravimetrischen Korrekturen erfordern, die auf den Sollwert der Zuführpumpe anzuwenden sind: Es wäre notwendig, die für die Zielzuführungsrate verwendete mathematische Funktion (über einen bestimmten Zeitraum) zu integrieren, um die gewünschte Menge der (über diesen Zeitraum) dosierten Feedlösung zu erhalten.

Die Differenz zwischen dieser gewünschten Menge und der tatsächlich dosierten Menge kann dann als Grundlage für die gravimetrischen Korrekturen verwendet werden. Wie bei der konstanten Fütterung in den Safi-Prozessen würden Gleichgewichtsstörungen, der Austausch von Feedflaschen und Änderungen der an der Feedgleichung beteiligten Parameter eine Neuberechnung der gravimetrischen Korrekturen erforderlich machen.

Schlussfolgerung

Die gravimetrische Perfusionslogik, die im Rahmen der Zusammenarbeit zwischen Safi und Securecell entwickelt wurde, geht über diese spezifische Anwendung hinaus. Der Ansatz befasst sich direkt mit den allgemeinen Herausforderungen bei der Perfusion großer Mengen - wie z. B. der begrenzten Auflösung des Gleichgewichts, dem variablen Gegendruck und der dynamischen Prozessskalierung - die von vielen Lucullus-Benutzern geteilt werden. Sobald diese Logik implementiert ist, kann sie von anderen Labors und Unternehmen, die ähnliche SCADA-gesteuerte Bioreaktorsysteme betreiben, leicht adaptiert werden und ermöglicht so eine genauere und stabilere Perfusionssteuerung in unterschiedlichen Setups.

Wichtigste Erkenntnisse

• Die Flexibilität von Lucullus® ermöglicht die erfolgreiche Automatisierung von Prozessen, selbst wenn einige der wichtigsten Anforderungen für die Automatisierung im Widerspruch zueinander stehen.
  
  

• Die Durchführung gravimetrischer Korrekturen auf der Basis der integrierten Durchflussrate bietet Vorteile gegenüber Korrekturen auf der Basis der aktuellen Durchflussrate, einschließlich einer höheren Präzision der dosierten Feedmenge über einen langen Zeitraum und der Möglichkeit, dies auch bei Skalen mit geringer Auflösung zu tun.
  
  

• Ein Nachteil der gravimetrischen Korrekturen auf der Grundlage des integrierten Durchflusses ist die Empfindlichkeit gegenüber Störungen der Waage, die das Feedgewicht misst, insbesondere wenn die Störung eine dauerhafte Verschiebung des aufgezeichneten Gewichts verursacht. Die Aufnahme von Schutzmechanismen in den Algorithmus ermöglicht es, dies wirksam zu bewältigen.

Liste der Mitwirkenden

Die gravimetrische Zufuhrkontrolle wurde von den Lucullus®-Anwendungsspezialisten Manuel Cantero und Rowin Timmermans von Securecell auf der Grundlage von Prozessanforderungen und iterativem Feedback des Forschungsteams von Safi Biotherapeutics, darunter Laura Erdos, Cathy Beltran-Rendon, Polina Vikhreva und Lee Berry, entwickelt und optimiert.