ERWEITERTE PROZESSÜBERWACHUNG: ZELLDICHTE- UND METABOLITENANALYSE IN DER ADENOVIRUS-PRODUKTION MIT LUCULLUS®

Materialien und Methoden

Die Produktion von adenoviralen Vektoren wurde in drei Bioreaktoren (AdV01, AdV02, AdV03) durchgeführt, und ein weiterer Bioreaktor wurde für reines Zellwachstum (CG) verwendet. Die detaillierten Betriebsparameter des Bioreaktors sind in Tabelle 1 aufgeführt. Alle 8 bis 12 Stunden wurden Proben für die Offline-Messung der Zelldichte und von vier Stoffwechselprodukten (Glukose, Glutamin, Laktat und Ammonium) entnommen.

Die Bioreaktoren wurden von einem Applikon my-Control Controller gesteuert, wobei die Daten von der Lucullus® Software in 5-Sekunden-Intervallen aufgezeichnet wurden. Kapazität und Leitfähigkeit wurden mit einer dielektrischen Sonde gemessen, wobei die Daten in 1-Minuten-Intervallen an Lucullus® übertragen wurden. Die von Lucullus® erfassten Daten zu Kapazität, Leitfähigkeit, gelöstem Sauerstoff, kumulativem Sauerstoff, kumulativem CO2, kumulativer Base, kumulativem Futter (Glukose und Glutamin) und pH-Wert wurden zur weiteren Analyse in MATLAB exportiert.

Arbeitsablauf der Datenanalyse

Abbildung 1 zeigt den Arbeitsablauf der Datenanalyse in dieser Studie. Die Vorverarbeitung der Daten umfasste die Nullsetzung der Kapazität auf der Grundlage der Messwerte des reinen Mediums und die Nullsetzung anderer Parameter auf der Grundlage der Inokulationswerte. Um die Signale mit den Offline-Messungen zu korrelieren, wurden die kumulativen Daten mit den Offline-Messungen abgeglichen, während die anderen Signale innerhalb eines 2-stündigen Zeitrahmens vor jeder Messung gemittelt wurden. Aus dem gelösten Sauerstoff und dem kumulativen Sauerstoff wurden zwei Indikatoren für die Sauerstoffaufnahmerate abgeleitet, wie in den Gleichungen 1 und 2 dargestellt.

Die partielle Kleinstquadratregression (PLS) und die lineare Regression (LR) wurden verwendet, um Signale mit Offline-Messungen zu korrelieren. Die Chargen CG, AdV01 und AdV03 wurden als Trainingsdatensatz verwendet, während die Charge AdV02 aufgrund der milden Infektionsbedingungen als Testdatensatz verwendet wurde. Die Anzahl der Komponenten in der PLS-Regression und die LR-Hyperparameter wurden durch 5-fache Kreuzvalidierung innerhalb der Trainingsgruppe konfiguriert. Die Modelle wurden mit allen genannten Prozessparametern oder ohne Kapazitäts- und Leitfähigkeitsdaten trainiert, die als PV bzw. PVDE bezeichnet wurden. Offline gemessene Zielgrößen wurden entweder direkt oder nach Subtraktion ihres ursprünglich bekannten Wertes verwendet (bezeichnet als PLS- und LR-). Die Kreuzvalidierung und die Vorhersageleistung wurden anhand der normalisierten mittleren quadratischen Fehler (nRMSE) verglichen. Einzelheiten zur Signalanalyse, zur Datenvorverarbeitung und zum Modelltraining sind in der Literatur zu finden [2].

Ergebnis

Für alle Zielvorhersagen lieferten die Modelle bei der Kreuzvalidierung eine gute Leistung, aber die Testleistung bei der Charge AdV02 schwankte, was wahrscheinlich auf die unterschiedlichen Bedingungen der einzelnen Chargen zurückzuführen ist. Die Einbeziehung der Signale der dielektrischen Sonde verbesserte die Leistung (verringerter nRMSEp), außer bei Laktat. Die beste Genauigkeit für jedes Ziel war vergleichbar mit den Ergebnissen, die mit fortschrittlichen spektroskopischen Techniken wie Raman- oder Fluoreszenzsonden für die Inline-Überwachung von Zelldichte und Metaboliten erzielt wurden [3, 4].

Bei der VCD-Vorhersage erreichten alle Methoden niedrige nRMSEcv-Werte von etwa 6 - 8 %, aber der nRMSEp war bei Modellen, die nur auf PV basieren, höher (Abbildung 2a). Das PVDE_PLS-Modell zeigte die beste Vorhersageleistung, da es die VCD auch nach der Infektion genau vorhersagte (Abbildung 2f), während die auf der Grundlage der VCD-Werte vor der Infektion kalibrierten Kapazitätsmesswerte höher waren als die Offline-Zellzahlen.

Bei der Glukoseüberwachung erreichten alle Modelle nRMSEcv-Werte von weniger als 5,5 %. Das Modell PVDE_LR wies den niedrigsten nRMSEp auf (3 %) (Abbildung 2b). Das PVDE_LR-Modell erzielte die beste Leistung bei der Glutaminüberwachung mit nRMSEcv- und nRMSEp-Werten von 4,7 % bzw. 6,9 % (Abbildung 2c). Die PV-Daten allein waren für die Laktatüberwachung ausreichend, wobei das PV-LR-Modell einen nRMSEp von 8,1 % ergab. Obwohl die Einbeziehung von DE-Informationen zu einem sehr niedrigen nRMSEcv für die Laktatüberwachung führt, scheint das Modell überangepasst zu sein, was durch einen hohen nRMSEp angezeigt wird. Dies könnte auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass AdV02 ein Fütterungslauf mit drei Fütterungen ist, während alle Trainingschargen nur eine einzige Fütterung enthalten. Infolgedessen gelingt es dem Modell nicht, die stark korrelierten Parameter zu entkoppeln: die kumulative Basis in PV, die unabhängig von der Fütterung ist, und die Leitfähigkeit in DE, die dies nicht ist. Diese Einschränkung könnte durch die Einbeziehung zusätzlicher Fütterungsdatensätze behoben werden, um die Verallgemeinerbarkeit des Modells und die Entkopplung der Parameter zu verbessern. Bei der Ammoniumüberwachung zeigten alle Modelle eine ähnliche Leistung, mit nRMSEcv-Werten zwischen 7,5 und 10 %. Das Modell PVDE_LR erreichte den niedrigsten Vorhersagefehler (nRMSEp = 9%).

Schlussfolgerung

Diese Studie zeigt, dass es möglich ist, Adenovirus-Produktionsprozesse unter Verwendung grundlegender Prozessparameter mit geeigneter Vorverarbeitung zuverlässig zu überwachen, ohne dass eine fortschrittliche spektroskopische Ausrüstung erforderlich ist. Durch die Einbeziehung der Signale der dielektrischen Sonde wurde die Überwachungsleistung für die meisten Ziele, mit Ausnahme von Laktat, weiter verbessert. Diese Arbeit zeigte auch den Wert der Lucullus®-Software für die übergreifende Prozessüberwachung, die zentrale und harmonisierte Datenspeicherung und die Prozesssteuerung. Obwohl MATLAB für die Datenanalyse verwendet wurde, sind die Vorverarbeitung der Daten und die Vorhersage in Echtzeit durch integrierte Lucullus®-Funktionen oder APIs möglich.

Lucullus®-Software

Die Lucullus® Bioprocess Software ist eine umfassende Softwarelösung für das Bioprozessdatenmanagement. Die Software bietet eine herstellerunabhängige Überwachung und Steuerung verschiedener Laborgeräte und ermöglicht die Automatisierung und Digitalisierung kritischer Arbeitsabläufe. Dazu gehören Prozessplanung, Medienvorbereitung, Prozessdurchführung, Probenmanagement und Prozessauswertung. Ausgestattet mit hochmodernen und anpassbaren Schnittstellen integriert sich Lucullus® nahtlos in Bioprozessumgebungen und gewährleistet eine effiziente Datenerfassung und einen effizienten Datenaustausch zwischen Geräten, Softwareplattformen und Datenbanken. Durch diese Integration werden Datensilos minimiert, Informationsverluste verhindert und der Bedarf an manueller Datenverarbeitung deutlich reduziert, was die Prozesssicherheit und -effizienz erhöht.

Referenzen

1. Petiot, E., et al., Influence of HEK293 metabolism on the production of viral vectors and vaccine. Vaccine, 2015.
   33(44): p. 5974 - 5981.
2. Xu, X., et al., Multivariate Datenanalyse zur Multisensormessung für die Inline-Prozessüberwachung der Adenovirus
   Produktion in HEK293-Zellen. Biotechnology and Bioengineering, 2024. 121(7): p. 2175 - 2192.
3. Oliveira Guardalini, L.G., et al., Biochemical monitoring throughout all stages of rabies virus-like particles production by Raman spectroscopy using global models. J Biotechnol, 2023. 363: p. 19 - 31.
4. Classen, J., et al., Ein neuartiges LED-basiertes 2D-Fluoreszenzspektroskopiesystem für die Inline-Bioprozessüberwachung von
   Chinese hamster ovary cell cultivations-Part II. Eng Life Sci, 2019. 19(5): p. 341 - 351.