Dieser Ansatz beruht auf Echtzeit-Massemessungen zur direkten Quantifizierung der geförderten Flüssigkeitsmenge und hilft, die inhärenten Schwankungen zu überwinden, die durch die Verformung der Schläuche und zeitabhängige Veränderungen der Pumpenleistung entstehen. Die gravimetrische Fütterung wird in den Fällen eingesetzt, in denen ein hohes Mass an Genauigkeit für die Fütterung des Bioreaktors erforderlich ist. Die Genauigkeit und Präzision der Waage sind von entscheidender Bedeutung, da die Messungen des Gewichts der Feedlösung durch die Waage die Grundlage für die Korrektur des Sollwerts der Feedpumpe bilden. Eine solche Einrichtung wird gemeinhin als gravimetrisch korrigierte Dosierung oder kurz als gravimetrischer Feed bezeichnet. Zum Einrichten einer gravimetrischen Zuführung (Abbildung 1) sind folgende Schritte erforderlich:
Ein Gerät mit einem eingebauten/programmierten Rückkopplungsmechanismus, der in der Lage ist, die notwendigen Berechnungen für die gravimetrische Feedsteuerung mit einer relativ hohen Frequenz durchzuführen. Einige Bioreaktorsteuerungen verfügen über diese Fähigkeit, aber meistens wird zu diesem Zweck ein Computer mit SCADA-Software wie Lucullus® eingesetzt.
Eine Pumpe für die Zuführung der Nährlösung zum Bioreaktor. Dabei kann es sich entweder um eine in die Steuerung des Bioreaktors integrierte Pumpe oder um eine unabhängige, eigenständige Pumpe handeln.
Eine Waage zur Messung des Feedgewichts, vorzugsweise mit hoher Präzision.
Sowohl die Pumpe als auch die Waage müssen physisch mit dem Gerät verbunden sein, das für die gravimetrische Feedkontrolle zuständig ist, um den Datenaustausch zwischen diesen Geräten zu ermöglichen. Damit die gravimetrischen Korrekturen so wirksam wie möglich sind, müssen die Messungen der Waage und die Korrektur des Pumpensollwerts mit einer relativ hohen Frequenz erfolgen.
In den folgenden Schritten wird die Funktionsweise des gravimetrischen Feedsteuerungsprinzips genauer beschrieben, wobei davon ausgegangen wird, dass die gravimetrische Dosierung durch die SCADA-Software Lucullus® von Securecell gesteuert wird:
Lucullus® aktiviert die Feedpumpe (pmp_feed_sp) auf der Grundlage der vom Bediener eingestellten gewünschten Feedrate (Feed_rate_target) (konstante Dosierung , lineare Dosierung , exponentielle Dosierung oder profilbasierte Dosierung).
Lucullus® sammelt Messwerte von der Waage, die das Gewicht der Feedlösung mit einer relativ hohen Rate misst, die vom Bediener festgelegt wird.
Lucullus® berechnet die tatsächliche Feedrate (Feed_rate_calc) auf der Grundlage von zwei aufeinanderfolgenden Waagenmessungen (balt, balt-1) in einem vom Bediener festgelegten Intervall (dt) (typischerweise 1 - 10 Minuten):
Die genaue Dauer des Intervalls muss sorgfältig abgestimmt werden: Ist das Intervall zu kurz, wirken sich Ungenauigkeiten der Waagenmesswerte relativ stark auf die berechnete Feedrate aus; ist das Intervall zu lang, kann die Förderpumpe länger als gewünscht vom Ziel abweichen.
Lucullus® vergleicht die tatsächliche Feedrate mit der gewünschten Feedrate und berechnet daraus einen gravimetrischen Korrekturfaktor (GFCF):
Wenn die Pumpe den Feed genau wie gewünscht dosiert, hat der Korrekturfaktor den Wert 1. Wenn nicht, ist der Wert entweder kleiner als 1 (die Pumpe füttert zu viel) oder grösser als 1 (sie füttert zu wenig).
Der Korrekturfaktor wird zur Anpassung der Pumpendrehzahl verwendet, um die gewünschte Fördermenge zu erreichen:
Die Schritte (2) - (5) werden in dem vom Bediener eingestellten Intervall (dt) wiederholt, wenn die Zufuhr andauern soll (ebenfalls vom Bediener eingestellt).
Das Lucullus®-Operations-Team bei Securecell ist auf Prozessautomatisierung spezialisiert und hat in der Vergangenheit bei verschiedenen Kunden erfolgreich Lösungen zur Korrektur gravimetrischer Fütterungen implementiert. Kürzlich kontaktierte der Lucullus®-Anwender Octarine Bio (Octarine) mit Sitz in der dänischen Hauptstadt Kopenhagen Securecell mit der Bitte, einen gravimetrischen Feed für einen seiner Prozesse einzurichten.
Octarine ist ein weltweit führendes Unternehmen der synthetischen Biologie, das sich auf die Entwicklung von Zellfabriken und Präzisionsfermentierung spezialisiert hat. Dadurch ist Octarine in der Lage, massgeschneiderte Mikroben zu entwickeln, die durch Fermentation eine breite Palette von biobasierten Inhaltsstoffen produzieren, wie z. B. Textilfarbstoffe, Hautpflegebestandteile, Nahrungsergänzungsmittel und viele andere neue und innovative Produkte (weitere Informationen finden Sie unter octarinebio.com).
Im Rahmen eines Kundenprojekts wurde in Lucullus® eine eigene Operation (Prozessrezeptur) zur Durchführung der gravimetrischen Feedkorrekturen programmiert und bei Octarine anhand von Live-Kultivierungen getestet. Basierend auf den Ergebnissen dieser ersten Tests wurde die Operation schrittweise verbessert und führte schliesslich zu einer Lösung, die die gewünschten Ergebnisse lieferte.
Für die Durchführung der Verfahren mit gravimetrischer Dosierung bei Octarine wurden die folgenden Geräte verwendet (Abbildung 2):
Computer mit installierter Lucullus®-Software (Version 23.0.0, Basic + Control Lizenz)
Ein 2-L-Bioreaktor von Getinge (1-L-Arbeitsvolumen)
Eine Livit Flex Bioreaktorsteuerung (Duale Konfiguration) von Getinge
Eine Waage Modell BCA12201-1S von Sartorius (0,1 g Genauigkeit)
Eine Modellwaage BCE42021-1S von Sartorius (0,01 g Genauigkeit)
Strategie für exponentielles Dosieren
Eine wichtige Voraussetzung für das Octarine-Verfahren war die exponentielle Dosierung, wie in der folgenden Formel dargestellt:
F(t) steht für die Dosierrate (g/h) zu einem bestimmten Zeitpunkt t ( h), F0 ist die anfängliche Dosierrate (g/h) und K der exponentielle Koeffizient (h-1). Die Werte für F0 und K wurden von Octarine (vertraulich) zur Verfügung gestellt.
Eine der in Lucullus® verfügbaren Ressourcen erwies sich als sehr wertvoll, um diese Anforderung zu erfüllen: ein sogenanntes Logical Device, die Exponentialrampe. Die Exponentialrampe wird speziell für die kontinuierliche Berechnung von Werten für F(t) auf der Grundlage von benutzerdefinierten Werten für F0 und K verwendet, wobei die Berechnungen zu jedem gewünschten Zeitpunkt während des Prozesses gestartet werden können.
Eine der grössten Herausforderungen bestand darin, exponentiell zu füttern und gleichzeitig Korrekturen am Sollwert der Förderpumpe vorzunehmen. Dies wurde dadurch gelöst, dass der Sollwert der Förderpumpe in einem benutzerdefinierten Intervall (Förderzyklus) in diskreten Schritten erhöht wurde. Ein Nachteil dieser Lösung in ihrer elementaren Form war, dass die Zellen systematisch unterfüttert wurden (Abbildung 3).
Die systematische Unterfütterung durch die elementare diskrete Dosierrate wurde korrigiert, indem in Lucullus® zwei Exponentialrampen statt nur einer programmiert wurden (beide mit den gleichen Werten für die Dosierparameter F0 und K, wie von Octarine bereitgestellt). Während der Ausführung eines Prozesses startet die zweite Exponentialrampe später als die erste Exponentialrampe, mit einer Verzögerung, die genau der Dauer eines vollen Fütterungszyklus entspricht. Auf diese Weise kann Lucullus® eine korrigierte diskrete Dosierrate für einen bestimmten Fütterungszyklus (Tabelle 1) berechnen, indem es den Durchschnitt der gewünschten Dosierrate zu Beginn dieses Fütterungszyklus (Exponentialrampe 2) und der gewünschten Dosierrate am Ende dieses Fütterungszyklus (Exponentialrampe 1) bildet (Abbildung 4).
Da eine Lösung für die exponentielle Zugabe von Nährlösung in den Bioreaktor mit diskreten Schritten zur Verfügung stand, war die Berechnung eines Korrekturfaktors für den Pumpensollwert einfach zu bewerkstelligen. Dies wird in der nachstehenden Gleichung verdeutlicht, in der der Parameter Feed_rate_target (siehe Abschnitt "Gravimetrisches Fütterungsprinzip") durch den Parameter Feed_rate_cycle (Mittelwert der mit Exponential Ramps 1 und 2 berechneten Werte) ersetzt wird.
Zu Beginn eines jeden Fütterungszyklus berechnet Lucullus® den Sollwert der Feedpumpe auf der Grundlage der beiden folgenden Eingaben:
Die diskrete Dosierrate pro Zyklus (Parameter Feed_rate_cycle), die auf dem Durchschnitt der von den Exponential Ramps 1 und 2 berechneten Werte basiert.
Der gravimetrische Korrekturfaktor (Parameter GRCF), der am Ende des vorherigen Fütterungszyklus berechnet wurde und als Multiplikationsfaktor verwendet wird. Beachten Sie, dass der GRCF für den allerersten Fütterungszyklus mit einem Wert von 1 beginnt (Abbildungen 7 und 8).
Neben der möglichst genauen Fütterung wurden weitere Anforderungen von Octarine in die Operation einprogrammiert. In Kombination mit den oben genannten Erkenntnissen und Schritten wurde die folgende Operation entwickelt (Abbildung 9).
Die Leistung der Operation wurde während des Live-Anbaus in Octarine getestet, und es wurden folgende Ergebnisse erzielt (Abbildungen 10 und 11).
Während des iterativen Prozesses der Programmierung, des Testens, der Analyse der Ergebnisse und der Neuprogrammierung entwickelte Securecell eine Simulation des gravimetrischen Dosiervorgangs in Excel. Die Simulation erwies sich als grosse Hilfe bei der Bestimmung der wichtigsten Faktoren, die zu einem ordnungsgemäss funktionierenden gravimetrischen Dosieralgorithmus beitragen, sowie bei der Angabe geeigneter Werte für bestimmte Parameter in den verschiedenen Berechnungen.
Vor allem die Genauigkeit der Waage, mit der das Gewicht der Feedlösung gemessen wird, erwies sich als kritisch. Dies ist vor allem in der sehr frühen Phase des Octarine-Prozesses der Fall, in der die Zufuhrrate extrem niedrig ist. Während der ersten Tests. Als die gravimetrische Korrektur angewandt wurde, stellte sich heraus, dass sie sich nachteilig auf die Zugabe von Feedlösung auswirkte, wenn die gewünschten Dosierraten sehr niedrig waren, was zu erheblichen Schwankungen bei der Zugabe von Feedlösung durch die Feedpumpe führte und die Kultur abwechselnd über- und unterfütterte. Mit Hilfe der Excel-Simulation wurde der kritische Faktor schnell ermittelt: die Genauigkeit der Waage (damals 0,1 g). Aufgrund dieser Erkenntnis beschloss Octarine, eine neue Waage mit einer höheren Genauigkeit von 0,01 g zu kaufen, um die bisher verwendete Waage mit 0,1 g Genauigkeit zu ersetzen. Dies führte zu einer dramatischen Verbesserung bei der berechneten gravimetrischen Korrektur des Sollwerts der Feedpumpe in den frühen Phasen des Prozesses.
Als weitere Verbesserung wurde ein Parameter in den Betrieb eingeführt, der als Zeitverzögerung zwischen dem Start der exponentiellen Zufuhr und dem Beginn der gravimetrischen Korrekturen wirkt. Dadurch können die Bediener bei Octarine die Kultur während der Anfangsphase der exponentiellen Zufuhr, wenn die Pumpe mit extrem niedrigen Zufuhrraten dosiert, vorübergehend ohne gravimetrische Korrekturen füttern. Die Dauer dieser Verzögerung kann von den Bedienern auf der Grundlage der Erfahrungen aus früheren Prozessen eingestellt werden, um den optimalen Zeitpunkt für die Aktivierung der gravimetrischen Korrektur zu finden.
Ein weiterer entscheidender Parameter für die Optimierung der gravimetrischen Korrektur der Feedpumpe ist die Dauer des Fütterungszyklus (Parameter FCT). Ist die Dauer des Fütterungszyklus relativ kurz, wirken sich kleine Schwankungen der Feedwaagenmessung erheblich auf die berechnete Dosiergeschwindigkeit (Parameter Feed_rate_calc) aus, was zu einer unerwünschten Ungenauigkeit des gravimetrischen Korrekturfaktors (Parameter Feed_rate_calc) führt, der teilweise auf diesem Parameter beruht. Ist die Dauer des Fütterungszyklus hingegen relativ lang, könnte die Feedpumpe über einen längeren Zeitraum zu wenig oder zu viel Feedösung zuführen, bevor eine Korrektur erfolgt. Auch dieser Parameter kann auf der Grundlage der Erfahrungen aus früheren Prozessen eingestellt werden, um den optimalen Wert zu finden. Im Fall von Octarine wurde der Wert des Fütterungszyklus schliesslich auf mehrere Minuten festgelegt (vertrauliche Daten).
Es wurde eine alternative Operation entwickelt, um die gravimetrischen Korrekturen gleichzeitig mit der in dieser Application Note beschriebenen Operation auszuführen. Die Erprobung und Fehlerbehebung dieser alternativen Operation waren zum Zeitpunkt des Abschlusses des Projekts in Octarine noch nicht vollständig abgeschlossen. Der Vorteil der alternativen Version der Operation besteht darin, dass die exponentielle Dosierung nicht in viele diskrete Fütterungsschritte unterteilt werden muss, wodurch Lucullus® in der Lage ist, den Sollwert der Feedpumpe kontinuierlich zu erhöhen (Abbildung 13). Dies wird erreicht, indem die berechneten Werte für den Pumpensollwert, die auf der exponentiellen Gleichung und dem aktuellen Wert des gravimetrischen Korrekturfaktors beruhen, über einen ganzen Fütterungszyklus hinweg integriert werden (Parameter FCT), woraus sich dann die erwartete Gewichtsabnahme der Futterlösung (Parameter dW_pred) ergibt (Abbildung 14).
Diese erwartete Gewichtsabnahme wird mit der tatsächlichen Gewichtsabnahme verglichen, die auf zwei aufeinanderfolgenden Waagenmessungen der Futterlösung beruht (Gewicht zu Beginn und am Ende eines Fütterungszyklus).
Der gravimetrische Korrekturfaktor wird dann in Abhängigkeit von diesen beiden Gewichtsdifferenzen berechnet.
Künftige Tests müssen durchgeführt werden, um diese alternative Version der Operation richtig zu bewerten und ihre Leistung mit der ursprünglichen Operation zu vergleichen. Es wird erwartet, dass durch die kontinuierliche Anpassung des Sollwerts der Feedpumpe die Genauigkeit der Fütterung noch besser sein wird als bei der Lösung, bei der der Sollwert der Förderpumpe periodisch angepasst wird.
Testimonial OctarineDie Einführung eines gravimetrischen Feedsystems ermöglicht eine genauere Kontrolle über die gewünschte Wachstumsrate bei Fermentationen im Fed-Batch-Verfahren. Dies verbessert die Biomasseausbeute an der Kohlenstoffquelle, so dass die optimale oder gewünschte Menge an Biomasse zu einem bestimmten Zeitpunkt der Fermentation erreicht wird. Die bessere Kontrolle über die Biomassebildung in den verschiedenen Stoffwechselphasen führt zu einer Steigerung des Produktertrags pro Biomasseeinheit. Darüber hinaus konnte die Reproduzierbarkeit des Fütterungsprofils zwischen den Fermentationsläufen deutlich verbessert werden. Dies wurde dadurch erreicht, dass die Pumpen nicht mehr kalibriert werden mussten und dass betriebliche Probleme im Zusammenhang mit Änderungen in der Anlage, wie z. B. Variationen der SChläuche und der Dichte der Feedlösung, vermieden wurden. Infolgedessen konnte die Charakterisierung des Fermentationsprotokolls verbessert werden, und es wurden systematischere Ergebnisse erzielt, während gleichzeitig die Übertragung der Fütterungsprofile an externe Partner vereinfacht wurde. Die Unterstützung von Securecell bei der Programmierung, dem Testen und der Fehlerbehebung war entscheidend für die Optimierung der Lucullus® Operations, um ein gravimetrisches Fütterungssystem zu erhalten, das genau wie gewünscht funktionierte. Die Erfahrung und die proaktive Arbeitsweise der Securecell-Ingenieure machten den Unterschied zwischen einer gut funktionierenden Lösung innerhalb des vorgegebenen Zeitrahmens für dieses Projekt oder nicht." |
Die gravimetrische Feedkontrolle ist eine sehr effektive Methode zur präzisen Dosierung von Zufuhrlösungen für Bioreaktorsysteme und unterstützt die Optimierung der Bioreaktorumgebung. Die erfolgreiche Anwendung der gravimetrischen Dosiersteuerung ist eine Herausforderung und erfordert eine Ausrüstung mit den richtigen Eigenschaften, Know-how über die wichtigsten Parameter sowie Erfahrung mit der Prozessautomatisierung.
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Wichtige Erkenntnisse • Die leistungsstarken Prozessautomatisierungsfunktionen von Lucullus® ermöglichen die erfolgreiche Umsetzung fortschrittlicher Prozesssteuerungsstrategien, wie z.B. die gravimetrisch korrigierte Zuführung bei Octarine. • Durch die Simulation des Fütterungsprozesses lassen sich wertvolle Erkenntnisse über die Leistungsfähigkeit der gravimetrischen Fütterungsregelung gewinnen. Sie hilft, die wichtigsten Einflussfaktoren zu ermitteln. • Die Präzision der Waage spielt eine Schlüsselrolle bei der korrekten Durchführung der gravimetrischen Futtermittelkorrektur, vor allem bei besonders niedrigen Vorschubgeschwindigkeiten. • Weitere wichtige Parameter zur Optimierung der gravimetrischen Fütterungsregelung sind die Häufigkeit der Berechnung des Korrekturfaktors (Fütterungszykluszeit) und die Verzögerungszeit zwischen dem Einschalten der Förderpumpe und dem Beginn der gravimetrischen Fütterungskorrekturen. |
Die gravimetrische Dosierregelung wurde von den Lucullus®-Anwendungsspezialisten Manuel Cantero und Rowin Timmermans von Securecell entwickelt und optimiert, basierend auf den Anforderungen und dem Feedback der Forschungswissenschaftler Luca Guerrini und Javier Fuentes Izquierdo von Octarine. Ein besonderer Dank geht an Kim Hanson und Tine Holbæk Levinsen von Holm and Halby für die Herstellung des Kontakts zwischen Octarine und Securecell.