Mikroorganismen werden seit Tausenden von Jahren zur Herstellung von Bier, Brot und fermentierten Lebensmitteln verwendet (Arranz-Otaegui et al., 2018; Liu et al., 2018). In jüngerer Zeit haben Fortschritte in der Biotechnologie und die Umweltauswirkungen der konventionellen Landwirtschaft das Interesse an einzelligem Protein als neue Möglichkeit zur Nutzung von Mikroorganismen in Lebensmitteln geweckt. Einzelliges Protein ist sehr nahrhaft, enthält bis zu 80 % Protein (Ravindra, 2000) und bietet eine nachhaltigere Alternative zur konventionellen Lebensmittelproduktion mit geringerem Land- und Wasserverbrauch, reduzierten Treibhausgasemissionen und dem Potenzial, auf Abfallsubstraten zu wachsen (Matassa et al., 2016; Spalvins et al., 2018).
Einzelzellprotein wird in der Regel durch submerse Hochzelldichtekulturen mit Dichten ≥ 20 g Trockengewicht L-1 hergestellt, wodurch die volumetrische Produktivität maximiert und gleichzeitig Volumen, Wasserverbrauch und Produktionskosten reduziert werden (Subramaniam et al., 2018). Die derzeitigen Verfahren werden jedoch durch die geringe Löslichkeit und Transportgeschwindigkeit von Sauerstoff in Wasser eingeschränkt, was häufig zu einer geringeren Ausbeute und einer Anhäufung von Nebenprodukten führt (Garcia-Ochoa & Gomez, 2009). Forscher an der Norwegischen Universität für Biowissenschaften (NMBU) haben sich dieses Problems angenommen und eine Methode für die anaerobe Kultivierung mit hoher Zelldichte entwickelt (Bakken et al., 2023; Maråk et al., 2024), die sich auf die Denitrifikation stützt, die dissimilatorische Reduktion von Nitrat (NO3-) zu Distickstoffgas (N2) über Nitrit (NO2-), Stickoxid (NO) und Distickstoffoxid (N2O) (Abbildung 1). Diese Form der anaeroben Atmung ist nach der aeroben Atmung die zweitwichtigste in Bezug auf den Energieertrag (Chen & Strous, 2013). Der anaerobe HCDC-Prozess basiert auf einem pH-Stat-Prinzip, bei dem die Bereitstellung eines Elektronenakzeptors (HNO3) direkt mit einem durch Denitrifikation verursachten Anstieg des pH-Werts verbunden ist. Dabei muss die Bereitstellung von Elektronenakzeptor, Kohlenstoffquelle/Elektronendonator und Mineralien sorgfältig ausbalanciert werden, um Einschränkungen, toxische Wirkungen oder Ungleichgewichte zu vermeiden, die die Anhäufung von Nebenprodukten wie Polyhydroxyalkanoaten (PHA) fördern könnten (Bedade et al., 2021; Shiloach & Fass, 2005). Eine weitere Herausforderung ist die Anhäufung vonCO2, das mit Wasser zu HCO3- und CO32- reagiert und den pH-Wert senkt, wodurch der mit der Denitrifikation verbundene pH-Anstieg, der sonst die Substratbereitstellung auslösen würde, verdeckt wird.
Vor diesem Hintergrund war es das Ziel, einen anaeroben Bioprozess für die Kultivierung hoher Zelldichten durch Denitrifikation mit ausgeglichener, pH-gesteuerter Substratzufuhr zu entwickeln, der nur minimal durchCO2 beeinflusst wird. Ein prozessspezifischer Vorgang in der Lucullus®-Software ermöglichte eine pH-gesteuerte Bereitstellung von HNO3 (und Mineralien), die mit der Bereitstellung der Kohlenstoff- und Stickstoffquellen im Gleichgewicht war. Zusätzlich wurden ein dynamischer pH-Sollwert und eine Durchflussrate für die Durchspülung implementiert, um die CO₂-bedingte Versauerung des Mediums zu verringern.
Alle Bioreaktorkulturen wurden mit Paracoccus pantotrophus GB17 durchgeführt, der an anaerobe Bedingungen in einem mineralischen Basalmedium mit 0,5 g L-1 MgSO4 - 7H2O, 0,1 g L-1 CaCl2 - 2H2O, 0,99 g L-1 KH2PO4, 7,45 g L-1 K2HPO4 und einer Mischung von Spurenelementen angepasst war. Das Medium wurde mit Glukose als Kohlenstoffquelle und Elektronendonor, NO3- als Elektronenakzeptor und NH4+ als Stickstoffquelle angereichert.
Die Kultivierungen mit hoher Zelldichte wurden in einem Bionet® F1-3-Bioreaktor mit einem Arbeitsvolumen von 3,0 l und einem Wasserkreislaufmantel zur Temperaturkontrolle durchgeführt. Der Bioreaktor war mit zwei Prozessgaszuführungen (beide an eine zentrale N2-Leitung angeschlossen), Kühlwasser, einem Rührwerkssystem, drei Pumpen mit fester Drehzahl (Säure-, Basen- und Entschäumerreservoir) und zwei Pumpen mit variabler Drehzahl (eine davon war an das Feedreservoir angeschlossen) ausgestattet. Der Prozess wurde mit der Software Lucullus® 3.11.5 von Securecell gesteuert. Der Behälter wurde kontinuierlich mit N2 gespült, um während der gesamten Kultivierung anoxische Bedingungen aufrechtzuerhalten.
Das mineralische Basalmedium wird vor der Sterilisation in das Gefäß gegeben. Die Behälter für Säure (5 M HNO3+ Mineralien), Base (1 M KOH), Futter (2,97 M Glukose, 1,42 M NH4NO3) und Entschäumer (Glanapon DB 870 von Busetti, auf 200-fache Konzentration verdünnt) wurden gefüllt und an den Bioreaktor angeschlossen. Eine anaerobe Vorkultur wurde als Inokulum für den Beginn jeder Kultivierung verwendet.
Der pH-Wert wurde kontinuierlich mit einem externen pH-Sensor (Hamilton EasyFerm Bio PHI Arc 325) überwacht. Die Abgase wurden zur Messung vonCO2 (nichtdispersiver Infrarotsensor) undO2 (Zirkoniumdioxid-Keramikelektrolyt mit gasdurchlässigen Platinelektroden) zum Bionet® bBreath-1 sowie zur Überwachung von NO und N2Ozu einem robotisierten Inkubationssystem (Molstad et al., 2007) geleitet. Während der gesamten Kultivierung wurden Flüssigkeitsproben für Offline-Messungen von Glukose (HPLC), Zelldichte (OD660) und NO2- (LCK342), NO3- (LCK340) und NH4+ (LCK340) mit Hach Lange DR3900 entnommen.
Die Software Lucullus® 3.11.5 von Securecell wurde für die Datenaufzeichnung und die erweiterte Prozesssteuerung der Bioreaktorprozesse verwendet. Eine Lucullus-Operation wurde speziell für die pH-stat-Kultur im Fed-Batch-Verfahren entwickelt (Abbildung 2).
Die Operation wird mit einem Benutzereingabeblock eingeleitet, in dem die Sollwerte für Temperatur und Rühren zugewiesen werden, zusätzlich zu mehreren kritischen Prozessvariablen, die in verschiedenen Berechnungen während des Prozesses verwendet werden, einschließlich des anfänglichen pH-Werts, des k-Werts (Verhältnis zwischen bereitgestelltem Feed und bereitgestellter Säure), des anfänglichen Volumens und der Parameter, die für die Temperatur-,CO2- und Sparringsteuerung verwendet werden. Dann folgt eine Vorbereitungsphase, in der die Temperaturregelung, das Rühren und das Durchblasen mit N2 eingeleitet werden. Wenn der Reaktor anoxisch ist und die Temperatur stabilisiert wurde (beides wird von Lucullus überprüft), wird der Benutzer aufgefordert, den Bioreaktor zu beimpfen.
Gleichung 1 wird im Betrieb so definiert, dass der pH-Sollwert auf der Grundlage derCO2-Konzentration im Abgas dynamisch während des Prozesses angepasst wird (Abbildung 3). Dabei ist ph_sp der pH-Sollwert, PH_0 der intrinsische pH-Wert des Mediums, offg_co2_pv die gemesseneCO2-Konzentration im Abgas, D_CO2 und D_HNO3 sind empirisch ermittelte Werte für die pH-Senkung pro EinheitCO2 bzw. HNO3 und SP_HNO3 ist die angestrebte HNO3-Konzentration im Medium.
Die Zufuhr von Futtermitteln muss mit dem über die Säure bereitgestellten Elektronenakzeptor ausgeglichen werden, um die Akkumulation von Speicherpolymeren oder Denitrifikationszwischenprodukten zu verhindern, von denen einige in hohen Konzentrationen toxisch sind. Dies wird durch einen Regelkreis erreicht (Abbildung 4, linker Regelkreis), der die Förderpumpe einschaltet, wenn das Gesamtvolumen des eingespritzten Futters geringer ist als das Volumen der eingespritzten Säure mal dem k-Wert (dem Verhältnis zwischen beiden).
Die Durchflussmenge beim Durchblasen wird von einem Regelkreis gesteuert, um denCO2-Gehalt im Abgas in einem akzeptablen Bereich zu halten (Abbildung 4, rechter Regelkreis). Ist dieCO2-Konzentration im Abgas höher als der vom Benutzer festgelegte hohe Schwellenwert, wird die Durchflussrate des Sparging in kleinen Schritten erhöht, bis dieCO2-Konzentration im Abgas reduziert ist. Ebenso wird die Durchflussrate reduziert, wenn dieCO2-Konzentration unter dem unteren Schwellenwert liegt.
Eine genaue Schätzung des gesamten Flüssigkeitsvolumens im Bioreaktor ist während des gesamten Prozesses erforderlich, da andere Berechnungen davon abhängen. Dies wird durch die Implementierung von Gleichung 2 erreicht , die das Gesamtvolumen (V_TOT) kontinuierlich auf der Grundlage des Anfangsvolumens im Behälter (V_INI), des eingespritzten Volumens aus jedem der Reservoirs (pmp_acid_tot, pmp_af_tot, pmp_base_tot, pmp_feed2_tot und pmp_feed_tot) und der kumulativen Benutzereinspritzungen (V_ADD_CUM) und Entnahmen (V_SMPL_CUM) aus dem Behälter berechnet.
Mit dem oben beschriebenen Verfahren wurden mehrere Kultivierungen hoher Zelldichten mit P. pantotrophus durchgeführt, ohne dass ein manuelles Eingreifen erforderlich war (Abbildung 5). Durch wiederholte Verdünnungszyklen mit frischem Medium und durch Aufrechterhaltung einer hohen Zelldichte über 300 Stunden wurden durchweg Konzentrationen von über 60 g Trockengewicht L-¹ erreicht. Die resultierende Biomasse hat einen durchschnittlichen Proteingehalt von 75 % und ein günstiges Aminosäureprofil. In der Reaktorflüssigkeit reichern sich keine Fermentationsprodukte oder toxischen Verbindungen an, wie durch HPLC, HS-GC und Bioassays zur Bewertung des Wachstums frischer Zellen in verbrauchter Reaktorflüssigkeit nachgewiesen wurde (Maråk, 2025).
Obwohl damit die Möglichkeit der anaeroben Kultivierung hoher Zelldichten mit guten Erträgen nachgewiesen wurde, ist die Wachstumsrate durchweg niedriger als bei Kulturen mit niedriger Dichte erwartet. Es wird vermutet, dass die Zellen aufgrund einer CO₂-vermittelten pH-Verzögerung, die die Bereitstellung von HNO₃ trotz der Implementierung eines CO₂-abhängigen dynamischen pH-Sollwerts und der N₂-Durchspülung verzögert, periodisch unter einem Mangel an Elektronenakzeptoren leiden. Diese Hypothese wird durch In-silico-Modellierung der pH-,CO2- und NO3--Kinetik unterstützt.
Die derzeitigen Bemühungen konzentrieren sich auf die Verbesserung der Produktionsraten durch Änderungen bei der Auswahl der Organismen, der Medienzusammensetzung und -versorgung sowie der Optimierung der Prozessparameter. Darüber hinaus werden Anpassungen des Betriebs erforscht, um die CO₂-vermittelte pH-Verzögerung weiter abzumildern und Hungerperioden zu vermeiden.
Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass eine anaerobe Kultivierung mit hoher Zelldichte möglich ist, wobei routinemäßig hohe Biomassekonzentrationen mit Erträgen erzielt werden, die dem Substrateinsatz entsprechen. Die Biomasse hat einen hohen Proteingehalt, wobei keine Anreicherung von Nebenprodukten oder Fermentationszwischenprodukten beobachtet wurde. Darüber hinaus hat sie in Fischfutterversuchen mit atlantischem Lachs und bei der In-vitro-Fleischzüchtung ihr Potenzial als Proteinquelle gezeigt (Maråk, 2025).
Das Verfahren basiert derzeit auf Glukose als Kohlenstoffquelle. Die große Stoffwechselvielfalt der denitrifizierenden Organismen ermöglicht jedoch die Verwendung nachhaltigerer Kohlenstoffquellen, wie z. B. grünes Methanol. Bei weiterer Optimierung hat dieser Prozess das Potenzial, eine skalierbare, sauerstoffunabhängige Plattform für die nachhaltige Proteinproduktion zu werden. Seine Flexibilität in Bezug auf das Ausgangsmaterial und seine Anwendbarkeit in allen Lebens- und Futtermittelsektoren machen es zu einem überzeugenden Kandidaten für künftige Bioproduktionsbemühungen.
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Wichtigste Erkenntnisse
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Der anaerobe pH-Stat-Betrieb wurde von Lucullus®-Anwendungsspezialist Rowin Timmermans von Securecell auf Grundlage der Anforderungen und Rückmeldungen von Marte Mølsæter Maråk, Doktorandin in der Gruppe für mikrobielle Ökologie und Physiologie (MEP) an der NMBU, entwickelt und optimiert.